Expression différentielle et régulation du gène HSP70 en phase de croissance chez les ruminants en réponse au stress thermique

Rapports scientifiques volume 12, Numéro d'article : 18310 (2022) Citer cet article

1280 accès

2 Citations

1 Altmétrique

Détails des métriques

Les protéines de choc thermique régulent le mécanisme physiologique d'adaptation au stress thermique au niveau cellulaire. La présente étude a été réalisée pour analyser la régulation du gène HSP70 à différents stades de croissance chez les ruminants dans les cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC). La relation entre l'expression du gène HSP et la thermotolérance de manière spécifique à l'âge chez les ruminants n'a pas été analysée. Par conséquent, le niveau d'expression de l'ARNm HSP70 a été examiné dans différents groupes d'âge de chèvres Jamunpari dans des conditions climatiques chaudes. L'expérience a été réalisée sur 32 animaux de chèvre Jamunapari appartenant aux tranches d'âge de 3 mois, 9 mois, 12 mois et adultes (2–3 ans). L'ARN total a été isolé des cellules mononucléaires du sang périphérique. La réponse physiologique telle que la température rectale (RT), la fréquence respiratoire (RR) et la fréquence cardiaque (FC) a été utilisée comme indicateur du stress thermique. L'indice d'humidité de la température (THI) a été utilisé comme indicateur de la gravité du stress environnemental. La gamme THI variait de 82,00 à 92,08 pendant la période expérimentale. Le niveau d'expression de l'ARNm HSP70 à l'âge de 9 mois des animaux était régulé positivement et significativement plus élevé que les autres groupes d'âge. Il a été observé que le niveau de transcrits de HSP70 dans les PBMC était le plus élevé dans le groupe d'âge de 9 mois et qu'un déclin lié à l'âge de l'expression de HSP70 a été observé à l'âge adulte. Sur la base de la réponse physiologique, les phénotypes contrastés de stress thermique ont été reconnus comme des individus sensibles au stress thermique (HSS) et tolérants au stress thermique (HST) et l'expression de l'ARNm HSP70 a été analysée à différents âges en réponse au stress thermique chronique. L'expression différentielle de l'ARNm des individus HSS à l'âge de 3 et 9 mois a montré l'expression de pli la plus élevée que HST. L'âge et le phénotype avaient un effet significatif (p < 0,01) sur la valeur du point de croisement (CP). L'expression du gène m-ARN HSP70 dans différents groupes d'âge était corrélée à la tolérance au stress thermique et cela pourrait être utilisé comme biomarqueur par les éleveurs pour analyser la réponse HSP in vivo chez les ruminants.

L'acclimatation thermique et l'adaptation thermique sont associées à une augmentation du niveau de base des protéines de choc thermique (HSP)1,2. Les HSP sont activés en réponse à divers facteurs de stress environnementaux et autres. Il a été observé que l'épithélium cutané libère une protéine de choc thermique pour mobiliser le choc thermique en réponse au stress thermique. L'expression de HSP70 inductible est multipliée par plusieurs lorsque la température de la peau se rapproche de la limite supérieure de la zone thermoneutre des ruminants. La voie de régulation du stress thermique protège le protéome de toutes les cellules en réponse aux températures élevées et aux dommages oxydatifs3,4. Au niveau cellulaire, la chaleur et d'autres facteurs de stress métaboliques induisent les HSP et augmentent l'expression des gènes en raison de l'activation des facteurs de transcription de choc thermique (HSF)5,6,7. Les HSP interagissent avec d'autres protéines cellulaires dans des conditions de stress et maintiennent l'homéostasie cellulaire8. Les animaux individuels réagissent au stress physiologique et environnemental en activant différentes voies de régulation du stress qui protègent les processus biologiques de base en favorisant le repliement des protéines. Les HSP sont libérées intracellulairement et extracellulairement sous une forme inductible en réponse au stress. La tolérance cellulaire au stress thermique est régulée par les HSP et HSP70 peut être un indicateur de stress dans les cellules9. Les HSP sont responsables du maintien de l'équilibre entre la survie et un système immunitaire efficace dans l'organisme afin de s'acclimater au stress10.

La capacité à résister au stress thermique est un élément important de la forme physique des adultes. Les cellules libèrent des protéines de choc thermique en réponse à des stress métaboliques ou environnementaux8. Il a été observé qu'il y avait une diminution de l'expression induite par la chaleur de l'ARNm de HSP 70 dans le fibroblaste primaire de rat avec le vieillissement11. De même, la baisse de l'expression induite par la chaleur de HSP70 dans des fibroblastes diploïdes humains en fonction du passage cellulaire (vieillissement in vitro) a été rapportée. La thermorégulation dépendante de l'âge au niveau physiologique a été observée chez l'homme ainsi que chez les animaux de laboratoire12. Il a également été montré que la HSP régule la tolérance au stress au niveau tissulaire in vivo13. Par conséquent, la présente étude a été réalisée pour analyser l'expression de l'ARNm HSP70 liée à l'âge en réponse au stress thermique chez les ruminants. L'étude a été réalisée in vivo pour observer le mécanisme de thermorégulation chez les animaux jusqu'à 1 an et les individus adultes pendant la période de stress thermique. L'expression de l'ARNm de HSP 70 a été analysée pendant la phase de croissance des ruminants jusqu'à l'âge de maturité et chez les animaux adultes en réponse au stress thermique. La régulation de l'expression de HSP70 vis-à-vis du processus de vieillissement in vivo n'a pas été réalisée chez les ruminants. L'expression différentielle de la protéine HSP70 n'est toujours pas analysée et comprise chez les ruminants, par conséquent la présente étude analyse le modèle d'expression de la protéine de choc thermique à différents âges pendant la période de stress thermique.

La température ambiante pendant la période expérimentale variait de 40 à 49,5 °C. L'indice de température et d'humidité (THI) variait de 82,0 à 92,08 pendant la période chaude. La réponse physiologique telle que la température rectale (RT), la fréquence respiratoire (RR) et la fréquence cardiaque (HR) a montré une grande variabilité chez les animaux pendant la période de stress thermique et est présentée dans le tableau 1. La plage de variabilité de RT, RR et HR était de 38,1 à 39,9 °C, 24 à 84 respirations/min et 100 à 160 battements/min pendant la période chaude, respectivement (tableau 1). La classification des différences phénotypiques au niveau de la population était basée sur les données présentées précédemment. Sur la base de la distribution du RR et du FC, les individus ayant un RR ≤ 34 (respirations/min) et un FC ≤ 108 (battements/min) ont été reconnus comme phénotype tolérant au stress thermique (HST). Cependant, un RR ≥ 50 (respirations/min) et un HR ≥ 130 (battements/min) ont été reconnus comme un phénotype sensible au stress thermique (HSS). La variation moyenne des réponses physiologiques pendant la période de stress thermique extrême par rapport au phénotype sensible au stress est présentée dans le tableau 2 et la figure supplémentaire 1. La moyenne de RT, RR et HR a montré une variation significative dans le phénotype sensible et tolérant au stress thermique. La moyenne de RT, RR et HR du phénotype sensible à la chaleur était de 39,277 °C, 70,923 respirations/min et 145,538 battements/min, respectivement. La moyenne des phénotypes sensibles et tolérants au stress thermique différait de 0,859 °C en RT, 39,650 respirations/min en RR et 37,083 battements/min en HR, respectivement. La variation moyenne des réponses physiologiques à différents âges en ce qui concerne le phénotype de stress HSS et HST est présentée dans le tableau 3. Les RT, RR et HR étaient significativement (P <0, 01) différents entre les phénotypes HSS et HST à différents groupes d'âge. Par conséquent, RT, RR et HR étaient significativement (P < 0,01) affectés par l'âge des animaux.

Le niveau d'expression relatif de l'ARNm de HSP70 a été analysé dans les différents groupes d'âge des chèvres Jamunapari pendant la période chaude. Le profil d'expression de l'ARNm de HSP70 a été analysé à 3, 9, 12 mois et chez l'adulte (2 à 3 ans) en ce qui concerne les phénotypes de stress. Les gènes de la glycéraldéhyde 3-phosphate déshydrogénase (GAPDH) et de la bêta actine (β-actine) ont été utilisés comme contrôle interne. La qualité du produit amplifié en utilisant la RT-PCR (Fig. 2 supplémentaire), la courbe d'amplification et le pic de fusion sont fournis dans les Fig. 3A et 3B supplémentaires. Le schéma d'expression relatif de l'ARNm du gène HSP70 à 3, 9, 12 mois et chez l'adulte a montré une régulation à la hausse de 5, 70, 23, 90, 4, 08 et 1, 51 par rapport au témoin adulte (sensible au stress thermique) (tableau 4 et figure 1). L'expression de l'ARNm était significativement plus élevée à l'âge de 9 mois chez les animaux par rapport aux autres groupes d'âge. L'expression du gène HSP70 à l'âge de 9 mois des chèvres Jamunapari était 23,9 fois plus élevée par rapport au calibrateur (groupe témoin). De plus, l'âge de 9 mois a montré un niveau d'ARNm 5, 86 fois et 15, 83 fois plus élevé que l'âge de 12 mois et l'adulte, respectivement (tableau 4 et figure 1).

Expression relative de l'ARNm (changement de pli) du gène HSP70 dans différents groupes d'âge de chèvre Jamunapari. 3 M, âge de 3 mois de l'animal ; 9 mois, âge de l'animal à 9 mois ; 12 M, âge de 12 mois de l'animal ; adulte, 2–3 ans d'âge des animaux. Les lectures du point de croisement (Cp) pour chaque échantillon inconnu ont ensuite été utilisées pour calculer la quantité de gène cible ou de ménage en utilisant la méthode du deuxième maximum dérivé avec le logiciel d'analyse Light cycler 480 version 1.5 (Roche Applied Science, Indianapolis, IL, USA ). Le GADPH et la β-actine ont été utilisés pour normaliser l'expression des gènes. L'individu sensible a été utilisé comme calibrateur positif pour obtenir une expression génique normalisée.

Cependant, l'expression différentielle de l'ARNm entre les phénotypes sensibles et tolérants au stress thermique indiquait que les individus HSS à 3, 9, 12 mois et à l'âge adulte présentaient une expression 3, 57, 32, 34, 3, 70 et 0, 54 fois plus élevée que le témoin. De même, les individus HST à 3, 9, 12 mois et adultes présentaient une expression 3,20, 17,66, 4,50 et 4,41 fois plus élevée que le témoin. L'expression de l'ARNm du gène HSP70 basée sur les phénotypes de stress thermique était 3, 57 et 32, 34 fois plus élevée dans le phénotype sensible au stress thermique à l'âge de 3 et 9 mois des animaux, respectivement. De même, le phénotype tolérant au stress thermique présentait une expression 3, 20 et 17, 66 fois plus faible à l'âge de 3 et 9 mois pendant la période chaude (tableau 5 et figure 2).

Expression relative de l'ARNm (Fold change) du gène HSP70 à différents groupes d'âge de la chèvre Jamunapari par rapport au phénotype HST et HSS. 3 M-HST, 3 mois d'âge de l'animal - Phénotype tolérant au stress thermique ; 3 M-HSS, 3 mois d'âge de l'animal - Phénotype sensible au stress thermique ; 9 M-HST, 9 mois d'âge de l'animal - Phénotype tolérant au stress thermique ; 9 M-HSS, 9 mois d'âge de l'animal - Phénotype sensible au stress thermique ; 12 M-HST, 12 mois d'âge de l'animal - Phénotype tolérant au stress thermique ; 12 M-HSS, 12 mois d'âge de l'animal - Phénotype sensible au stress thermique ; Adulte-HST, Adulte (2-3 ans) âge de l'animal - Phénotype tolérant au stress thermique ; Adulte-HSS, Adulte 92-3 ans) âge de l'animal - Phénotype sensible au stress thermique. Les lectures du point de croisement (Cp) pour chaque échantillon inconnu ont ensuite été utilisées pour calculer la quantité de gène cible ou de ménage en utilisant la méthode du maximum de dérivée seconde avec le logiciel d'analyse Light cycler 480 version 1.5 (Roche Applied Science, Indianapolis, IL, USA ). Le GADPH et la β-actine ont été utilisés pour normaliser l'expression des gènes. L'individu sensible a été utilisé comme calibrateur positif pour obtenir une expression génique normalisée.

La moyenne des moindres carrés de la valeur du point de croisement (CP) a été analysée dans les différents groupes d'âge des chèvres Jamunapari. Le tableau 6 montre l'effet de la saison de naissance, du type de naissance, du sexe, de l'âge, du phénotype et de la parité. Le phénotype HSS a montré une CP significativement plus élevée (p < 0,01) que le phénotype HST. L'interaction sexe par phénotype a montré une différence significative (p < 0,01) sur le CP (tableau 7). Cependant, il n'y avait pas de différence significative observée dans la saison de naissance, le type de naissance et le sexe sur CP. Le tableau ANOVA a révélé que l'âge, le phénotype et la parité avaient un effet significatif (p <0,01) sur la PC (tableau 8). De même, la saison de naissance, le type de naissance, l'âge et la parité avaient un effet significatif (p < 0,01) sur le poids corporel.

HSP 70 joue un rôle protecteur lors du stress thermique et régule également la croissance et la prolifération cellulaires normales. Les HSP protègent les cellules contre l'apoptose médiée par le stress oxydatif24. La tolérance au stress thermique cellulaire est régulée par les HSP25,26,27 et le HSP70 est considéré comme un marqueur de la tolérance au stress thermique chez différentes espèces28,29. La régulation du stress thermique liée à l'âge et la tolérance thermique dans des conditions environnementales chaudes chez le bétail n'ont pas été bien comprises. Le modèle d'expression de l'ARNm de HSP70 a montré que l'expression du gène HSP70 était significativement plus élevée à l'âge de 9 mois par rapport à 12 mois et à l'âge adulte chez les chèvres Jamunapari. L'expression de l'ARNm HSP70 était environ 5,85 et 15,75 fois plus élevée par rapport à 12 mois et à l'âge adulte. Le niveau d'expression du gène m-ARN HSP70 à 3, 9, 12 mois et à l'âge adulte a montré une régulation à la hausse de 5, 70, 23, 90, 4, 082 et 1, 51 par rapport au témoin adulte (individus sensibles au stress thermique). La croissance et le développement des chèvres se produisent de manière similaire par rapport aux autres ruminants et mammifères. La croissance est une fonction du cycle de vie de chaque animal qui commence avec la fécondation de l'embryon et se termine avec la mort. Les cellules sont l'unité de base de la croissance et du développement. Les taux de croissance et de développement sont régis à la fois par le potentiel génétique et par des facteurs environnementaux. La phase fœtale de croissance va de la différenciation à la parturition. Les facteurs qui affectent la croissance et le développement postnatals sont le potentiel génétique et l'influence de l'environnement et de la nutrition pour atteindre la constitution génétique. Les chèvres atteignent la maturité à l'âge de 9 mois et c'est l'âge de maturation du système immunitaire. Comme il est évident, l'immunité maternelle affecte l'individu jusqu'à l'âge de 6 mois. Par conséquent, 9 mois est l'âge de sélection d'un individu pour sa croissance et d'autres caractéristiques économiques. La maturité sexuelle est l'âge auquel les mammifères peuvent se reproduire et atteindre le développement à chaque phase. La famille des rongeurs atteint la maturité sexuelle à l'âge de 1 à 2 mois, la famille des chiens et des bovidés atteint la maturité sexuelle à environ 1 an et les primates, y compris les êtres humains, atteignent la maturité à l'âge de 23 ans30. La croissance et le développement sont déterminés par des facteurs uniques et multiples interactifs des environnements externes et internes. Il est nécessaire de comprendre la croissance et le développement des chèvres et les facteurs qui affectent ces processus car ils déterminent l'efficacité de la production et la qualité des produits. Le taux et l'efficacité de la croissance et les effets subséquents sur la qualité des produits doivent être manipulés de la conception à la consommation pour une meilleure santé humaine et une gestion efficace des ressources31. L'exploration des modèles d'expression et leur pertinence dans la survie et l'adaptation sont très prometteuses pour l'amélioration du bétail et les régimes d'élevage.

De même, l'expression de l'ARNm de HSP70 à 3, 9, 12 ans et chez l'adulte était de 3, 57, 32, 34, 3, 70 et 0, 54 fois dans le phénotype HSS et de 3, 20, 17, 66, 4, 50 et 4, 41 fois dans le phénotype HST, respectivement. L'expression différentielle de l'ARNm a indiqué que les individus HSS âgés de 3 et 9 mois avaient une expression plus élevée que HST. De même, une étude du profil d'expression des gènes d'ARNm pour HSP60 et HSP70 a également été rapportée chez des chèvres Saanen32. De plus, une corrélation significativement positive de HSP70 et 60 a été observée entre les conditions environnementales et les paramètres physiologiques chez les chèvres laitières33. Le profil saisonnier des concentrations de HSP60 et 70 a été signalé comme étant inférieur en hiver par rapport à l'été et a trouvé une corrélation positive et significative entre la concentration de HSP et les données physiologiques chez les chèvres34. Dans cette étude, les animaux de 1 à 2 ans (groupe le plus jeune) ont montré la plus forte augmentation de l'expression de HSP par rapport aux individus de 3 à 4 ans et de 5 à 6 ans. De plus, une variation saisonnière a également été enregistrée avec le niveau de HSP70 avec une expression élevée de HSP60 et HSP70 pendant l'été par rapport aux autres saisons. Ces résultats sont également cohérents avec les petits mammifères, en particulier les rongeurs, tels que les rats mâles Wistar11. Il a été établi qu'il y avait une diminution de l'expression induite par la chaleur de l'ARNm de HSP70 dans le fibroblaste primaire de rat âgé de 11 ans. jeunes rats (4–7 mois) exposés à 42,5 °C pendant 30 min35. Dans la présente étude, les réponses physiologiques ont indiqué une variation significative au sein du phénotype sensible au stress thermique et tolérant. De même, HSP70 au niveau sérique était associé à certains paramètres physiologiques chez les chèvres laitières dans des conditions de dinde du sud 36. Chez Drosophila melanogaster, l'expression dépendante de l'âge et du sexe de HSP70, HSP22 et HSF1 a été étudiée et a observé que l'expression de HSP70 diminue tout au long de la vie. -portée. L'induction de HSP est importante dans le maintien de l'homéostasie, alors un déficit de son expression pourrait contribuer à une diminution de la tolérance au stress liée à l'âge. Des alternances dans la fonction de l'axe hypothalamo-hypophysaire (HPA) sont connues pour se produire avec l'âge37,38,39,40,41,42,43. Bien qu'il ait été rapporté qu'il n'y a pas de déficit lié à l'âge pour provoquer une réponse corticosurrénalienne au stress aigu, il a été suggéré qu'une activité HPA réduite se produit chez les animaux âgés après une exposition répétée au stress44. Ainsi, le déclin de l'expression de HSP70 avec l'âge pourrait refléter un changement dans l'activité HPA plutôt qu'une alternance intrinsèque dans la régulation du gène HSP70. HSP70 semble jouer un rôle protecteur pour faire face à ces conditions de stress et peut fonctionner pour protéger les cellules contre les défis ultérieurs13,45,46.

La régulation de l'expression du gène HSP70 est complexe. De même, la baisse de l'expression induite par la chaleur de HSP70 dans les fibroblastes diploïdes humains en fonction du passage cellulaire (vieillissement in vitro). Le mécanisme de transcription de HSP70 varie en fonction de l'âge et peut être dû à une altération associée à l'âge du mécanisme de signalisation de la réponse au choc thermique47. La thermorégulation dépendante de l'âge au niveau physiologique a été observée chez l'homme ainsi que chez les animaux de laboratoire12. Dans une étude préliminaire utilisant des cellules mononucléaires du sang périphérique humain, une impédance de 30 % de la transcription du gène codant pour HSP70 induite par la chaleur a été observée chez les personnes âgées par rapport aux jeunes48. Chez l'homme, la Hsp70 sérique était positivement corrélée avec l'âge dans les 30 ans et négativement corrélée avec le niveau de Hsp70 dans les lymphocytes après 40 ans49. Les présents résultats pourraient améliorer notre compréhension du mécanisme de la thermotolérance chez les ruminants pendant la phase de croissance et des facteurs affectant la croissance et les traits économiques. Par conséquent, il est nécessaire d'analyser la corrélation entre l'expression de l'ARNm et l'expression des protéines dans différents groupes d'âge pendant la période de stress thermique. De même, il est également nécessaire d'évaluer les protéines sériques de l'animal et de déterminer l'indice d'équilibre du choc thermique (eHsp70/iHsp70) dans une population particulière pour une meilleure adaptabilité et maintenir la productivité dans les variations climatiques changeantes.

Le niveau d'expression de l'ARNm HSP70 à l'âge de 9 mois des animaux était régulé à la hausse par rapport aux autres groupes d'âge. Les niveaux d'ARNm HSP70 étaient plus élevés chez les individus HST à l'âge de 3 et 9 mois de la chèvre Jamunapari. L'âge de 9 mois est l'âge de sélection des individus pour la croissance et d'autres caractéristiques économiques. L'expression du gène m-ARN HSP70 dans différents groupes d'âge était corrélée à la tolérance au stress thermique et cela pourrait être utilisé comme biomarqueur pour les éleveurs afin d'analyser la réponse HSP in vivo chez les ruminants.

L'expérience a été réalisée à l'unité d'élevage Jamunapari de l'ICAR-Institut central de recherche sur les chèvres (ICAR-CIRG), Makhdoom, Mathura, Uttar Pradesh, Inde. Jamunapari est l'une des races de chèvres les plus productrices de lait et de grande taille en Inde, répartie dans la région semi-aride de l'Uttar Pradesh14. Le climat dans la zone d'étude était semi-aride, avec une température moyenne de 45 °C et des précipitations d'environ 400 mm pendant la période expérimentale. Les animaux (chèvres) ont été hébergés séparément en fonction de leur sexe, de leur âge, de leur état de santé et de leur état physiologique, et ont été gérés dans un système d'élevage semi-intensif avec un temps de pâturage de 6 à 7 heures. Des aliments pour animaux appropriés, y compris du fourrage sec et du fourrage vert, ont été fournis en fonction de l'état physiologique et de la production. Le score d'état corporel était adéquat et uniforme pour tous les animaux. A intervalles réguliers, le troupeau était vacciné et vermifugé.

L'enquête a été menée sur la race de chèvres Jamunapari de la région semi-aride de l'Inde et classée en quatre groupes d'âge, comme indiqué dans le tableau 9. Chez les chevreaux en pleine croissance, les réponses physiologiques telles que la fréquence respiratoire (RR), la fréquence cardiaque (HR) , et la température rectale (RT) ont été enregistrées comme indicateurs de stress thermique. Les réponses physiologiques ont été enregistrées pendant la température la plus élevée de la journée allant de 13h30 à 14h30. La réponse physiologique à différents âges a été enregistrée trois fois sur une période de 8 à 10 jours (mai à juin). Un thermomètre clinique numérique a été utilisé pour mesurer la température rectale (précision ± 0,1 °C). RR et HR ont été mesurés par auscultation comme décrit précédemment 15.

Les données sur les variables météorologiques (humidité relative (%), ensoleillement (h), précipitations (mm), température de bulbe sec (DBT) et température de bulbe humide (WBT) et température) ont été enregistrées à l'ICAR- Institut central de recherche sur les chèvres, Makhdoom, Farah, Mathura. Le THI a été calculé à partir des températures de l'air des bulbes sec et humide pour un jour donné selon la formule suivante :

où, les bulbes secs et humides sont la température en degrés Celsius. La collecte et l'enregistrement des réponses physiologiques par rapport au THI le plus élevé pendant la période de stress thermique maximal variaient de 82,00 à 92,08. Le THI pourrait être utilisé pour prédire les conditions climatiques thermiques16. Période de stress thermique extrême, la température ambiante moyenne variait de 40,0 à 49,5 ° C et l'humidité relative variait de 14,33 à 51,0 et les animaux étaient exposés au rayonnement pendant 4 à 5 h pendant 28 jours.

Pour distinguer les deux phénotypes contrastés, la distribution de la fréquence respiratoire et de la fréquence cardiaque élevées et de la fréquence respiratoire et de la fréquence cardiaque faibles a été utilisée. Chez les chèvres, l'activité respiratoire et la fréquence cardiaque servent d'indicateurs de tolérance au stress thermique, et les individus sont classés comme tolérants ou sensibles au stress thermique. La classification phénotypique du stress thermique chez les caprins a été largement décrite au niveau de la population ailleurs 17,18,19,20,21.

Environ 3 à 4 ml d'échantillons de sang frais de chaque animal ont été prélevés de manière aseptique dans des tubes Vacutainer héparinés (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, États-Unis) par ponction de la veine jugulaire et immédiatement transportés sous réfrigération pour l'isolement de l'ARN. Les directives éthiques ont été suivies lors de la collecte de sang. Les échantillons de sang ont été dilués avec du PBS, pH 7,4 (1:2) et ensuite déposés sur un volume de HiSep LSM-1077 (Hi-Media). Les précautions ont été prises pour produire une interface propre entre deux couches de sang et le milieu HiSep. Les échantillons ont été centrifugés à 3000 tr/min à 4 ° C pendant 30 min et la fraction mononucléaire blanche opaque des cellules de l'interface a été aspirée dans des tubes de microcentrifugeuse (MCT) frais. Du diéthylpyrocarbonate (DEPC)-phosphate tampon salin (DPBS) a été ajouté pour remettre en suspension les PBMC caprins et centrifugé davantage pour le lavage à 5 000 tr/min pendant 5 min. Enfin, le culot cellulaire obtenu a été transféré dans un microtube stérile traité au DEPC.

L'ARN total a été isolé des PBMC en utilisant la méthode TRIzol (Invitrogen). Un millilitre de TRIzol a été remis en suspension pour dissoudre le culot de PBMC. Par la suite, la méthode d'isolement de l'ARN a été suivie selon Rout et Kaushik et al. 17,20. La qualité et la quantité d'ARN ont été évaluées par Biophotometer (Eppendorf) en utilisant OD260 pour la concentration et les rapports 260/280 et 260/230 pour évaluer la pureté de l'échantillon. L'intégrité de l'ARN a été testée sur un gel d'agarose à 1,4 % et des échantillons qui ont réussi le test de pureté (A280 ~ 1,9) ont été utilisés pour la synthèse d'ADNc. 1 µg d'ARN a été utilisé pour la préparation d'ADNc par le kit de synthèse d'ADNc premier brin du transcripteur (Roche) suivant le protocole du fabricant, et l'ADNc ainsi obtenu a été stocké à - 70 ° C pour une utilisation future. Le traitement à la DNase a été utilisé pour éliminer la contamination par l'ADN de l'ARN, comme décrit précédemment17. La PCR en temps réel a été analysée dans le Light Cycler 480 (Roche Applied Science, Indianapolis, IL, USA) en utilisant le mélange maître SYBR Green® (Roche) conformément aux instructions du fabricant. La réaction a été mise en place dans une plaque à 96 puits et chaque puits contenait 2 μL d'échantillon d'ADNc, 10 μL de SYBR green I master mix (Roche Applied Science, Indianapolis, IL, USA), 1 μL (20 pmol) des amorces spécifiques et eau sans nucléase pour obtenir un volume final de 20 μL. Les amorces du gène HSP70 (5' TCATCGGAGATGCAGCCAAGAA-3' et R-5' AGATCTCCTCGGGGAAGAAGGT 3') ont été utilisées avec une température d'annelage de 61 °C pour amplifier un fragment de 210 pb. GAPDH (F-5′ GTGATGCTGGTGCTGAGTAC3′ et R-5′ GTAGAAGAGTGAGTGTCGC-3′) et β-Actine (F-5′ TGCCCT GAGGCTCTCTTCCA′ et R- 5′ TGCGGATGTCGACGTCACA-3) ont été utilisés pour normaliser l'expression génique du gène HSP70 .

Le profil thermique a été standardisé comme dénaturation initiale à 94 ° C pendant 10 min, suivie de 45 cycles, dénaturation à 94 ° C pendant 10 s, recuit à 61 ° C pendant 15 s et extension à 72 ° C pendant 20 s. Les tests ont été réalisés en double. Les produits de PCR ont été soumis à une analyse de la courbe de fusion dans le Light cycler 480, puis à une électrophorèse sur gel d'agarose à 3 % pour confirmer la spécificité de l'amplification et la taille de l'amplicon.

Une quantification relative a été effectuée pour mesurer le facteur de variation des niveaux d'expression des gènes cibles à l'aide de la méthode 2–∆∆Ct et de la méthode E22. La quantification relative avancée a été réalisée en utilisant la méthode du maximum de la dérivée seconde avec le logiciel d'analyse Light Cycler 480 version 1.5 (Roche Applied Science, Indianapolis, IL, USA). Toutes les analyses ont été effectuées sur la valeur moyenne de Cp, qui a été calculée à partir de deux réplicats d'échantillons utilisés dans la PCR en temps réel.

L'expression et les réponses physiologiques au sein des phénotypes de stress ont été analysées. Pour l'ajustement des constantes, une analyse des moyennes des moindres carrés du modèle mixte a été utilisée pour déterminer l'effet statistiquement significatif de divers facteurs génétiques et non génétiques23. Le modèle inclut l'effet fixe de la saison de naissance (2 niveaux), du type de naissance (2 niveaux), du sexe (2 niveaux), de l'âge (4 niveaux), du phénotype (2 niveaux), de la parité (4 niveaux) et de l'effet d'interaction. Le point de croisement (CP) du gène HSP70 et du poids corporel de la chèvre Jamunapari a été ajusté en tant que covariable linéaire dans le modèle.

Modèle 1 :

où, Yijklmn est l'observation de la ième saison de naissance, du jième type de naissance, du kième sexe, du lième groupe d'âge, du mième phénotype, de la nième parité, µ = population de moyenne, Saison de naissance = effet fixe de la ième saison de naissance (février-mars et octobre-novembre = 1 et 2), Type de naissancej = effet fixe du jème type de naissance (Célibataire et Gémeaux, J = 1 et 2), Sexek = effet fixe du kème sexe (Homme et Femme, K = 1 et 2), Agel = effet fixe du 1ème groupe d'âge (3 mois, 9 mois, 12 mois et adultes l = 1, 2, 3 et 4), Phénotypem = effet fixe du mème phénotype (tolérant au stress thermique et sensible au stress thermique , m = 1 et 2), Parityn = effet fixe de la nième parité (Parité = 1 à 4), Eijklmn = erreur résiduelle aléatoire associée à une observation de moyenne 0 & variance 1.

Tous les prélèvements d'échantillons ont été effectués conformément aux pratiques institutionnelles et l'étude a été approuvée par le comité institutionnel d'éthique animale (IAEC/CIRG/18–19). Les normes d'arrivée ont été suivies pendant le processus d'approbation éthique.

Les ensembles de données utilisés et/ou analysés au cours de l'étude en cours sont disponibles auprès de l'auteur correspondant sur demande raisonnable.

Carper, SW, Duffy, JJ & Gerner, EW Protéines de choc thermique dans la thermotolérance et d'autres processus cellulaires. Peut. Rés. 47(20), 5249–5255 (1987).

CAS Google Scholar

Kregel, KC Révision invitée—Protéines de choc thermique : facteurs de modification des réponses au stress physiologique et thermotolérance acquise. J. Appl. Physiol. 92, 2177-2186 (2002).

Article CAS PubMed Google Scholar

Calderwood, SK, Murshid, A. & Prince, T. Le choc du vieillissement : les chaperons moléculaires et la réponse au choc thermique dans la longévité et le vieillissement - Une mini-revue. Gérontologie 55(5), 550–558 (2009).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kim, B., Park, K. & Rhee, K. Réponse au stress thermique des cellules germinales mâles. Cellule. Mol. Vie Sci. 70(15), 2623–2636 (2013).

Article CAS PubMed Google Scholar

Sorger, PK La régulation transcriptionnelle des gènes de choc thermique (thèse de doctorat) (Université de Cambridge, Cambridge, 1987).

Google Scholar

Sorger, PK, Lewis, MJ & Pelham, HR Le facteur de choc thermique est régulé différemment dans les cellules de levure et HeLa. Nature 329(6134), 81–84 (1987).

Article ADS CAS PubMed Google Scholar

Zimarino, V. & Wu, C. Induction de la liaison spécifique à la séquence de la protéine activatrice de choc thermique de Drosophila sans synthèse protéique. Nature 327(6124), 727–730 (1987).

Article ADS CAS PubMed Google Scholar

Lindquist, S. & Craig, EA Les protéines de choc thermique. Annu. Rév. Genet 22, 631–677 (1988).

Article CAS PubMed Google Scholar

Sonna, LA, Fujita, J., Gaffin, SL & Lilly, CM Revue invitée : Effets du stress dû à la chaleur et au froid sur l'expression des gènes des mammifères. J. Appl. Physiol. 92(4), 1725–1742 (2002).

Article CAS PubMed Google Scholar

Morange, F. HSF en développement. Handb. Exp. Pharmacol. 172, 153–169 (2006).

Article CAS Google Scholar

Fargnoli, J., Kunisada, T., Fornace, AJ, Schneider, EL & Holbrook, NJ Diminution de l'expression de l'ARNm de la protéine de choc thermique 70 et de la protéine après traitement thermique dans les cellules de rats âgés. Proc. Natl. Acad. Sci. 87(2), 846–850 (1990).

Article ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Finch, CE, Landfield, PW dans Handbook of the Biology of Aging (eds. Finch, CE & Schneider, EL) (Van Nostrand Reinhold, New York, 1978) pp. 567–594.

Barbe, MF, Tytell, M., Gower, DJ & Welch, WJ L'hyperthermie protège contre les dommages légers dans la rétine du rat. Sciences 241 (4874), 1817–1820 (1988).

Article ADS CAS PubMed Google Scholar

Rout, PK, Kaushik, R., Ramachandran, N. & Jindal, SK Identification des phénotypes sensibles et tolérants au stress thermique chez les chèvres des régions tropicales semi-arides. Science de la production animale 58(7), 1349–1357 (2017).

Article Google Scholar

Andrews, AH Médecine vétérinaire. Dans A textbook of the Diseases of Cattle Sheep Pigs Goats and Horses (eds Blood, DC & Radostits, OM) 1502 (Baillière Tindall, Londres, 1988).

Google Scholar

McDowell, RE, Hooven, NW & Camoens, JK Effet du climat sur la performance des Holstein en première lactation. J. Dairy Sci. 59(5), 965–997 (1976).

Article Google Scholar

Rout, PK, Kaushik, R. & Ramachandran, N. Modèle d'expression différentielle du gène de la protéine de choc thermique 70 dans les tissus et phénotypes de stress thermique chez les chèvres pendant la période de stress thermique maximal. Chaperons de stress cellulaire 21(4), 645–651 (2016).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kaushik, R., Dige, MS & Rout, PK Caractérisation moléculaire et profilage de l'expression du gène ENOX2 en réponse au stress thermique chez les chèvres. Cellule Dév. Biol 5, 1–5 (2016).

Google Scholar

Kaushik, R., Dige, M., Dass, G., Ramachandran, N. & Rout, PK Activité de la superoxyde dismutase en réponse au stress thermique chez les chèvres Jamunapari. Indian J. Biochem. Biophys. 55(1), 39–43 (2018).

CAS Google Scholar

Kaushik, R., Goel, A. & Rout, PK Expression différentielle et caractérisation du gène ATP1A1 exon17 par analyse de fusion à haute résolution et RT-PCR chez des chèvres indiennes. Mol. Biol. Rep. 46(5), 5273–5286 (2019).

Article CAS PubMed Google Scholar

Kaushik, R., Goel, A. & Rout, PK Établir la variation génétique de la réponse physiologique en réponse au stress thermique dans la région semi-aride chez les chèvres Jamunapari. Biol. Rythme. Rés. 51(1), 1–14 (2020).

Article CAS Google Scholar

Livak, KJ & Schmittgen, TD Analyse des données d'expression relative des gènes à l'aide de la PCR quantitative en temps réel et de la méthode 2−ΔΔCT. Méthodes 25(4), 402–408 (2001).

Article CAS PubMed Google Scholar

Harvey, WR Guide de l'utilisateur pour LSMLMW Dans: Programme informatique des moindres carrés du modèle mixte et du maximum de vraisemblance PC-Version, Vol. 2, (Ohio State University Press, Ohio, 1990).

Beere, HM et al. La protéine de choc thermique 70 inhibe l'apoptose en empêchant le recrutement de la procaspase-9 dans l'apoptosome Apaf-1. Nat. Cell Biol. 2(8), 469–475 (2000).

Article CAS PubMed Google Scholar

Sonna, LA, Fujita, J., Gaffin, SL & Lilly, CM Revue invitée : Effets du stress dû à la chaleur et au froid sur l'expression des gènes des mammifères. J. Appl. Physiol. 92(4), 1725–1742 (1985).

Article Google Scholar

Hecker, JG et al. Les protéines de choc thermique HSP70 et HSP27 dans le liquide céphalo-rachidien des patients subissant une réparation d'anévrisme thoracique sont en corrélation avec la probabilité de paralysie postopératoire. Chaperons de stress cellulaire 13(4), 435–446 (2008).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Hecker, JG & McGarvey, M. Protéines de choc thermique comme biomarqueurs pour la détection rapide de l'ischémie du cerveau et de la moelle épinière : examen et comparaison avec d'autres méthodes de détection dans la réparation des anévrismes thoraciques. Chaperons de stress cellulaire 16(2), 119–131 (2011).

Article CAS PubMed Google Scholar

Archana, PR et al. Rôle des protéines de choc thermique dans l'adaptation du bétail au stress thermique. J. Dairy Vet. Anim. Rés. 5(1), 00127 (2017).

Google Scholar

Hyder, I. et al. Thermotolérance chez les ruminants domestiques : une perspective HSP70. Dans Heat Shock Proteins in Veterinary Medicine and Sciences (eds Alexzander, AA & Asea, PK) 3–35 (Springer, Cham, 2017).

Chapitre Google Scholar

Pacifici, M. et al. Durée d'une génération chez les mammifères. Nat. Conserv. 13(5), 84–89 (2013).

Google Scholar

Webb, EC & Casey, NH Limites physiologiques de la croissance et effets connexes sur la qualité de la viande. Vivre. Sci. 130(1–3), 33–40 (2010).

Article Google Scholar

Yilmaz, M., Kayki, M., Aşici, G. & Kiral, F. Les profils d'expression des gènes d'ARNm pour HSP60 et HSP70 chez diverses chèvres Saanen âgées à différentes saisons. Kafkas Üniv. Vétérinaire. Faux. Derg. 24(1), 563–569 (2018).

Google Scholar

Alyamani, D., Koluman, N. (2019) Expressions associées de la protéine de choc thermique (70 et 60) à l'adaptation physiologique chez les chèvres laitières. Disponible au SSRN 3535801.

Alyamani, D. Impact différentes saisons sur les modèles d'expression HSP60 et les paramètres physiologiques. J Dairy Vet Anim Res 9(1), 1–4 (2020).

Google Scholar

Heydari, AR, Wu, B., Takahashi, RYOYA, Strong, RANDY & Richardson, A. L'expression de la protéine de choc thermique 70 est modifiée par l'âge et le régime alimentaire au niveau de la transcription. Mol. Cellule. Biol. 13(5), 2909-2918 (1993).

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Yamani, HAL & Koluman, N. Association HSP70 avec certains paramètres physiologiques chez la chèvre laitière dans les conditions du sud de la Turquie. J. Produits laitiers. Vétérinaire. Anim. Rés. 9(5), 148–151 (2020).

Google Scholar

Pavlov, EP, Harman, SM, Chrousos, GP, Loriaux, DL & Blackman, MR Réponses de l'adrénocorticotropine plasmatique, du cortisol et de la déhydroépiandrostérone à l'hormone de libération de la corticotropine ovine chez des hommes vieillissants en bonne santé. J.Clin. Endocrinol. Métab. 62(4), 767–772 (1986).

Article CAS PubMed Google Scholar

Roth, G. Cerveau Res. 107, 354–349 (1976).

Article Google Scholar

Brodish, A. & Odio, M. Effets dépendants de l'âge du stress chronique sur les réponses de l'ACTH et de la corticostérone à un nouveau stress aigu. Neuroendocrinologie 49(5), 496–501 (1989).

Article CAS PubMed Google Scholar

Ottenweller, JE, Tapp, WN, Pitman, DL & Natelson, BH Interactions entre les effets du vieillissement, des maladies chroniques et du stress sur la fonction corticosurrénalienne chez les hamsters syriens. Endocrinologie 126(1), 102–109 (1990).

Article CAS PubMed Google Scholar

Landfield, PW, Waymire, JC & Lynch, G. Vieillissement de l'hippocampe et adrénocorticoïdes : corrélations quantitatives. Sciences 202(4372), 1098-1102 (1978).

Article ADS CAS PubMed Google Scholar

Sapolsky, RM, Krey, LC & McEWEN, BS Les récepteurs de la corticostérone déclinent de manière spécifique au site dans le cerveau du rat âgé. Cerveau Res. 289(1–2), 235–240 (1983).

Article CAS PubMed Google Scholar

Sapolsky, RM, Krey, LC & McEwen, BS La neuroendocrinologie du stress et du vieillissement : l'hypothèse de la cascade des glucocorticoïdes. Endocr. Rév. 7, 284–297 (1986).

Article CAS PubMed Google Scholar

Odio, M. & Brodish, A. Adaptation liée à l'âge des réponses hypophyso-surrénaliennes au stress. Neuroendocrinologie 49(4), 382–388 (1989).

Article CAS PubMed Google Scholar

Finley, D., Ciechanover, A. & Varshavsky, A. Thermolabilité de l'enzyme d'activation de l'ubiquitine du mutant du cycle cellulaire de mammifère ts85. Cellule 37(1), 43–55 (1984).

Article CAS PubMed Google Scholar

Gershon, H. & Gershon, D. Molécules d'enzymes inactives chez les souris vieillissantes : aldolase hépatique. Proc. Natl. Acad. Sci. 70(3), 909–913 (1973).

Article ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Liu, AY, Lin, Z., Choi, HS, Sorhage, F. & Li, B. Induction atténuée de l'expression du gène de choc thermique dans les fibroblastes diploïdes vieillissants. J. Biol. Chim. 264(20), 12037–12045 (1989).

Article CAS PubMed Google Scholar

Deguchi, Y., Negoro, S. & Kishimoto, S. Chaperons moléculaires et processus de vieillissement Biochem. Biophys. Rés. Commun. 157, 580-584 (1998).

Article Google Scholar

Jin, X. et al. Niveaux sériques et lymphocytaires de la protéine de choc thermique 70 dans le vieillissement : une étude dans la population chinoise normale. Chaperons de stress cellulaire 9(1), 69 (2004).

2.0.CO;2" data-track-action="article reference" href="https://doi.org/10.1379%2F1466-1268%282004%29009%3C0069%3ASALLOH%3E2.0.CO%3B2" aria-label="Article reference 49" data-doi="10.1379/1466-1268(2004)0092.0.CO;2">Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Télécharger les références

Les auteurs remercient le directeur de l'ICAR-Institut central de recherche sur les chèvres, Makhdoom, Farah, Mathura et Uttar Pradesh, Inde pour avoir fourni les installations nécessaires à la réalisation des travaux de recherche.

Département de biotechnologie, Université GLA, 17Km Stone, NH-2, Mathura-Delhi Road, Chaumuhan, Mathura, 281406, UP, Inde

Rakesh Kaushik et Anjana Goel

Division de la génétique animale et de l'élevage, ICAR-Institut central de recherche sur les chèvres, Makhdoom, Farah, Mathura, 281122, UP, Inde

Rakesh Kaushik et PK Rout

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

RK : Collecte d'échantillons, expérience en laboratoire, expérience qRT-PCR, analyse de l'expression génique, logiciel utilisé pour l'analyse des données et la rédaction de manuscrits - révision et édition. SA ; rédaction de manuscrits - révision et édition, PKR : développement de concepts, conception expérimentale, analyse et rédaction de manuscrits - ébauche originale, révision et édition.

Correspondance à Rakesh Kaushik ou PK Rout.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

Libre accès Cet article est sous licence Creative Commons Attribution 4.0 International, qui permet l'utilisation, le partage, l'adaptation, la distribution et la reproduction sur n'importe quel support ou format, à condition que vous accordiez le crédit approprié à l'auteur ou aux auteurs originaux et à la source, fournir un lien vers la licence Creative Commons et indiquer si des modifications ont été apportées. Les images ou tout autre matériel de tiers dans cet article sont inclus dans la licence Creative Commons de l'article, sauf indication contraire dans une ligne de crédit au matériel. Si le matériel n'est pas inclus dans la licence Creative Commons de l'article et que votre utilisation prévue n'est pas autorisée par la réglementation légale ou dépasse l'utilisation autorisée, vous devrez obtenir l'autorisation directement du détenteur des droits d'auteur. Pour voir une copie de cette licence, visitez http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Réimpressions et autorisations

Kaushik, R., Goel, A. & Rout, PK Expression différentielle et régulation du gène HSP70 pendant la phase de croissance chez les ruminants en réponse au stress thermique. Sci Rep 12, 18310 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-22728-6

Télécharger la citation

Reçu : 18 avril 2022

Accepté : 18 octobre 2022

Publié: 31 octobre 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-022-22728-6

Toute personne avec qui vous partagez le lien suivant pourra lire ce contenu :

Désolé, aucun lien partageable n'est actuellement disponible pour cet article.

Fourni par l'initiative de partage de contenu Springer Nature SharedIt

En soumettant un commentaire, vous acceptez de respecter nos conditions d'utilisation et nos directives communautaires. Si vous trouvez quelque chose d'abusif ou qui ne respecte pas nos conditions ou directives, veuillez le signaler comme inapproprié.