Microbiome intégré - Jiangsu Human Nutrition Co., Ltd.

Données scientifiques volume 10, Numéro d'article : 280 (2023) Citer cet article

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Un dépôt excessif de graisse peut déclencher des maladies métaboliques, et il est crucial d'identifier les facteurs qui peuvent rompre le lien entre le dépôt de graisse et les maladies métaboliques. Les porcs Laiwu (LW) obèses en bonne santé sont riches en matières grasses mais résistants aux maladies métaboliques. Dans cette étude, nous avons comparé le microbiome fécal, le métabolome fécal et sanguin et le génome des porcs LW et Lulai (LU) pour identifier les facteurs pouvant bloquer le lien entre le dépôt de graisse et les maladies métaboliques. Nos résultats montrent des différences significatives dans les spirochètes et les tréponèmes, qui sont impliqués dans le métabolisme des glucides, entre LW et LU. La composition des métabolomes fécaux et sanguins était similaire, et certains composants de maladies anti-métaboliques des métabolites sanguins étaient différents entre les deux races de porcs. L'ARN différentiel prédit est principalement enrichi en métabolisme des lipides et en métabolisme du glucose, ce qui est cohérent avec les fonctions du microbiote différentiel et des métabolites. Le gène RGP1 régulé à la baisse est fortement corrélé négativement avec Treponema. Nos données omiques fourniraient des ressources précieuses pour de nouvelles recherches scientifiques sur l'obésité saine chez l'homme et le porc.

Un dépôt excessif de graisse peut entraîner des dommages chroniques aux organes et des maladies métaboliques1,2,3. Cependant, les facteurs génétiques seuls ne peuvent pas entièrement expliquer ces conditions4. Le rôle des facteurs métaboliques, tels que le microbiote intestinal et les métabolites5,6,7,8, fait l'objet d'une attention croissante dans la compréhension des causes des maladies métaboliques chroniques induites par l'obésité9,10,11. Il a été démontré que les changements dans la composition du microbiote intestinal déclenchent des maladies métaboliques chroniques, notamment l'hypertension, l'athérosclérose et le diabète sucré de type 2 (T2DM)12,13,14. Le microbiote produit des métabolites essentiels tels que le N-oxyde de triméthylamine (TMAO) est directement lié aux maladies métaboliques chroniques, telles que l'athérosclérose, le DT2, les maladies cardiovasculaires (MCV) et les accidents vasculaires cérébraux15,16,17,18. De plus, le microbiote intestinal peut fermenter des glucides non absorbés/non digérés pour produire des acides organiques aliphatiques comme les acides gras à chaîne courte (AGCC)19,20. Les AGCC peuvent protéger l'hôte de l'obésité induite par l'alimentation grâce aux récepteurs couplés aux protéines G, et le microbiote régule indirectement le métabolisme des lipides de l'hôte par l'intermédiaire des AGCC21,22,23. Ainsi, les microbes intestinaux agissent comme un organe endocrinien, produisant des métabolites bioactifs qui affectent la physiologie de l'hôte7,24,25,26. À l'inverse, des études récentes ont montré que le génome de l'hôte peut influencer les phénotypes apparentés en modifiant le microbiote intestinal. Par exemple, les génotypes ABO peuvent influencer la structure du microbiote intestinal en régulant la N-acétylgalactosamine (GalNAc)27. Par conséquent, l'intégration de l'analyse omique peut aider à identifier les facteurs clés qui protègent les individus contre les maladies métaboliques.

Les porcs ont tendance à résister aux maladies métaboliques telles que la stéatose hépatique non alcoolique (NAFLD), le DT2 et les maladies cardiovasculaires, bien qu'ils soient nourris avec des régimes riches en graisses, en fructose et en glucides28,29. Ce phénomène est similaire à l'obésité métabolique saine (MHO) qui sont obèses mais protègent contre les maladies métaboliques30. Le porc démostique chinois Laiwu (LW) est connu pour sa forte teneur en matières grasses, y compris la graisse sous-cutanée et la graisse intramusculaire (IMF)31,32,33,34. En particulier, l'IMF de LW atteignait plus de 7%, la moyenne atteignait 11,6% et l'individu le plus élevé atteignait 21%. LW a été croisé avec le porc commercial de l'Ouest Yorkshire (YS) pour élever le porc Lulai (LU) qui a 50% d'infiltration du gène LW35. La teneur en matières grasses de LU était inférieure à celle de LW, et l'IMF était d'environ 5 %. Dans cette étude, nous avons choisi huit porcs LW et huit porcs LU avec un régime alimentaire, une hygiène et des conditions environnementales similaires pour une gestion centralisée sur deux ans (tableau 1). Nous avons traité le microbiome fécal, le métabolome fécal, le métabolome sanguin et le génome entier des porcs cibles (comme le montre la figure 1) pour identifier les facteurs clés qui protègent les individus contre les maladies métaboliques grâce à l'analyse d'intégration des omiques.

Représentation schématique du flux de travail pour la collecte d'échantillons microbiome-métabolome-génome-omique, le traitement des échantillons et le traitement des données.

En conclusion, notre étude a généré un ensemble de données de haute qualité sur le métagénome fécal, le métabolome fécal, le métabolome sanguin et les séquences du génome entier de porcs LW et LU. Le métagénome fécal a produit 34,5 gigaoctets (Go) et 35 Go de lectures brutes non assemblées et a révélé des différences significatives dans l'abondance des spirochètes et des tréponèmes, qui sont impliqués dans le métabolisme des glucides. Nous avons identifié un total de 1 220 métabolites dans le métabolome fécal et 713 métabolites dans le métabolome sanguin, tous deux riches en acides gras à chaîne moyenne et longue. Le métabolome sanguin contenait certains composants de maladies anti-métaboliques, tels que les acides gras hydroxy, la tanshinone IIA et la bétaïne. Le génome entier a obtenu en moyenne 21,9 Gb de lectures appariées avec un nombre total de 23,5 millions de polymorphismes nucléotidiques simples (SNP) provenant de 18 autosomes. L'analyse Fst (indice de fixation, statistiques F de Wright) des SNP a identifié 4 voies KEGG (encyclopédie kyoto des gènes et des génomes), y compris la sécrétion biliaire et la digestion et l'absorption des graisses, qui étaient enrichies dans le 1% supérieur de Fst. L'analyse de l'expression de l'ARN des tissus adipeux de 16 porcs a identifié 412 gènes différentiellement exprimés, qui étaient enrichis dans 9 voies KEGG, y compris le métabolisme de l'amidon et du saccharose et le métabolisme des glycérophospholipides. L'annotation fonctionnelle des gènes différentiels a montré que le métabolisme des lipides et du glucose étaient les principales fonctions enrichies, cohérentes avec les fonctions du microbiote différentiel et des métabolites. De plus, le gène RGP1 régulé à la baisse s'est avéré être fortement corrélé négativement avec Treponema, indiquant que l'expression de RGP1 était étroitement liée au changement d'abondance de Treponema. En résumé, notre étude fournit de nouvelles informations sur le rôle du microbiote intestinal, des métabolites et de la génétique de l'hôte dans le développement des maladies métaboliques. L'identification de facteurs anti-obésité ou anti-maladies métaboliques par l'intégration de données microbiomiques-métabolomique-génomiques a le potentiel de conduire au développement de nouvelles stratégies thérapeutiques pour ces maladies.

Notre expérience a été conçue pour comparer huit porcs femelles Laiwu (LW) avec huit porcs femelles Lulai (LU) qui se sont croisés entre les races LW et Yorkshire. Tous les porcs sont nés et ont été élevés pendant environ deux ans (715 ± 33 jours, tableau 1) dans des conditions de logement et d'alimentation uniformes à la ferme porcine de Jing-Qi-Shen dans la province de Jilin, en Chine. La température, l'humidité et la lumière variaient selon les conditions climatiques naturelles. Des porcelets de différentes mères ont été utilisés et un porcelet par portée a été choisi au hasard. Les porcelets étaient d'âge similaire, les porcs les plus âgés et les plus jeunes de l'expérience étant séparés de 66 jours. Pendant la période d'allaitement, les porcelets restaient avec leur mère, puis ils étaient transférés dans une porcherie avec mangeoires automatiques. Les porcelets ont été nourris cinq fois par jour, trois fois avant l'accouplement et une fois le matin et le soir après la gestation. Lorsque les truies étaient sexuellement matures, elles participaient à un accouplement sexuel et à une mise bas normaux. Les truies n'étaient pas gestantes au moment du prélèvement de l'échantillon.

Les temps de caca des porcs étaient irréguliers et la collecte des échantillons s'étendait de 10 h à 17 h. L'échantillonnage a été effectué pour les échantillons de matières fécales et de sang. Pour garder les échantillons fécaux exempts de contamination, nous portons des gants stériles jetables propres et capturons le fumier de porc avant qu'il ne touche le sol. Les échantillons fécaux frais ont été immédiatement conservés dans des tubes de prélèvement d'échantillons qui ont été préparés et pré-remplis avec un agent protecteur d'ADN bactérien. Les échantillons fécaux ont ensuite été placés dans de l'azote liquide pour un refroidissement rapide. Deux tubes d'échantillons fécaux ont été prélevés sur chaque porc, un pour le profilage du microbiome et un autre pour le profilage du métabolome. Le même groupe de porcs a subi un jeûne nocturne de 14 heures avant le prélèvement de l'échantillon de sang. Cinq millilitres de sang ont été prélevés de la veine jugulaire de chaque porc à l'aide d'une seringue. Le sang frais a été conservé dans un tube procoagulant sanguin et placé à température ambiante pendant une heure. Le mélange sanguin a ensuite été centrifugé à 3 000 g à 4 °C pendant 10 minutes. Le sérum supérieur de sang a été transféré dans un tube propre de 1,5 ml. Tous les échantillons fécaux et sanguins ont été étiquetés et transportés avec de la neige carbonique au laboratoire pour un traitement ultérieur.

Nous avons utilisé le kit d'isolement d'ADN EZNAsoil (OMEGA, Norcross, GA, US) pour extraire l'ADN du microbiote en suivant les instructions du fabricant. L'absorbance à une densité optique (DO) de 1,8 à 2,0 et une électrophorèse sur gel d'agarose à 1 % ont été utilisées pour évaluer l'intégrité et la qualité de l'ADN, et notre échantillon d'ADN répondait à ces critères. La séquence d'ADN entière a été découpée en courts fragments à l'aide d'un système Covaris M220 (Qsonica, USA). Les fragments de 300 pb ont été construits dans une bibliothèque d'extrémités de paires (PE) à l'aide d'un kit de préparation d'échantillons d'ADN TruSeq™ (Illumina, San Diego, CA). La bibliothèque PE a été évaluée à l'aide du kit de cluster Truseq PE v3-cBot-HS (Illumina, San Diego, CA), et l'amplification du fragment de bibliothèque a été réalisée à l'aide de la réaction en chaîne par polymérase (PCR). Nous avons utilisé des échantillons de 1,5 μg pour le séquençage de nouvelle génération (NGS) dans un Illumina NovaSeq. plate-forme 6000.

Les données de séquençage NGS de sortie ont été conservées au format fastq. Les données brutes ont été vérifiées pour le contrôle qualité à l'aide de Trimmomatic36 (v0.39) et traitées à l'aide des critères suivants : (a), si la valeur de masse moyenne était inférieure à 20 dans la fenêtre glissante de réglage de 50 bp, la queue des lectures de qualité de non-conformité était abandonné; (b), les séquences contenant deux nucléotides inconnus (marqués d'un N) ont été abandonnées ; (c), les séquences avec contamination de l'adaptateur ont été exclues ; (d), les longueurs de séquence inférieures à 50 pb et les valeurs de masse de queue inférieures à 20 ont été exclues. Après le découpage, des séquences de haute qualité sont restées. Afin d'exclure les séquences obtenues à partir du génome de l'hôte, les séquences restantes ont été cartographiées sur le génome de référence de l'ADN porcin (Sscrofa 11.1) et Burrows-Wheeler Aligner37 (v0.7.17) a été utilisé pour supprimer les lectures à haute similarité. Les séquences restantes ont été assemblées de novo en contigs à l'aide de Megahit38 (v1.1.1). Enfin, les contigs d'assemblage avaient leurs cadres de lecture ouverts (ORF) prédits à l'aide de MetaGeneMark39 (v3.25). Les séquences ont été regroupées à l'aide de CD-HIT40 avec des paramètres définis à 95 % de cohérence et 90 % de couverture. Les séquences les plus longues de chaque cluster ont été sélectionnées pour construire un catalogue de gènes non redondant. Ensuite, les séquences de haute qualité restantes ci-dessus ont été comparées au catalogue de gènes non redondants (fixé à 95 % d'identité) à l'aide de SOAPaligner41, et nous avons obtenu un ensemble de gènes particulier et une abondance de gènes. L'ensemble de gènes a été comparé à la base de données de séquences de protéines non redondantes (base de données NR) à l'aide de BLAST (v2.2.28) pour obtenir l'annotation taxonomique et l'abondance (la valeur e du paramètre d'alignement a été définie sur 1e-5). Enfin, les abondances taxonomiques des six niveaux de classification du règne, du phylum, de la classe, de l'ordre, de la famille, du genre et de l'espèce ont été analysées.

Des échantillons fécaux et sanguins ont été extraits et analysés séparément. Avant le traitement des échantillons, nous avons préparé au préalable 3 échantillons de contrôle de qualité (QC) qui étaient des échantillons LW et LU mélangés en quantités égales. Ensuite, les échantillons LW, LU et QC ont été séparés à 100 μl en mélangeant avec 100 μl d'eau pré-refroidie et 800 μl de méthanol/acétonitrile pré-refroidi (1:1, v/v). Les mélanges ont été placés sur le bain de glace et soumis aux ultrasons pendant 60 minutes. Pour précipiter les protéines, les mélanges ont été transférés dans un réfrigérateur à -20 ° C et incubés pendant 1 heure. Le surnageant a été transféré dans des tubes stériles propres et a été centrifugé à 16 000 g, 4 °C pendant 20 minutes. Ensuite, nous avons utilisé une centrifugeuse d'enrichissement sous vide à grande vitesse pour sécher le surnageant. La poudre séchée a été remise en suspension en ajoutant 100 μL de solution acétonitrile/eau (1:1, v/v), et cette solution a été centrifugée à 16 000 g, 4 °C pendant 15 minutes.

La séparation chromatographique a été réalisée par la plateforme Agilent 1290 Infinity LC Ultra-High Performance Liquid Chromatography (UHPLC) avec une spectrométrie de masse à temps de vol quadripolaire (AB Sciex Triple TOF 5600) et une colonne HILIC (Agilent 1290 infinity). Les échantillons QC qui ont été utilisés pour évaluer la stabilité du système et la fiabilité des données ont été insérés dans la file d'attente d'échantillons. La température de la colonne était de 25 °C et le débit était de 0,3 mL/min. Il y avait deux phases mobiles, la phase A contenait de l'eau, de l'acétate d'ammonium 25 mM et de l'eau ammoniacale 25 mM, la phase B ne contenait que de l'acétonitrile. La procédure de fonctionnement du système de phase mobile a été définie comme suit : 95 % B à 0–0,5 min ; 95 % à 65 % de B à 0,5–7 min ; 65 % à 40 % de B à 7–9 min ; 40 % B maintenu à 9–10 min ; 40 % à 95 % de B à 10–11,1 min ; 95 % B maintenu à 11,1–16 min.

Le mode ion positif ou négatif des composants a été détecté à l'aide de l'ionisation par électrospray (ESI). La condition de la source ESI a été définie comme suit : source d'ions gas1 (Gas1), 60 psi ; source d'ions gaz2 (Gaz2), 60 psi ; gaz rideau (CUR), 30 psi; température de la source, 600 °C ; tension ionique flottante (ISVF), ±5 500 V ; Gamme m/z de balayage TOF MS, 60–1200 Da ; gamme m/z de balayage d'ions de produit, 25–1200 Da ; Temps d'accumulation de balayage TOF MS, 0,15 s/spectre ; temps d'accumulation du balayage des ions produit, 0,03 s/spectre. La spectrométrie de masse secondaire a été obtenue à l'aide d'une acquisition dépendante de l'information (IDA) et a été utilisée en mode haute sensibilité, potentiel de désagrégation (DP), ± 60 V; énergie de collision, 30 eV. L'IDA a été fixée comme suit : exclure les isotopes à moins de 4 Da ; ions candidats à surveiller par cycle, 6.

Les données brutes de spectrométrie de masse (MS) ont été converties en fichiers mzXML par ProteoWizard. Le programme XCMS du logiciel MSDIAL a été utilisé pour l'alignement des pics, la correction du temps de rétention et l'extraction de la surface des pics. Pour les données extraites, supprimé les pics d'ions avec des valeurs manquantes> 50% dans le groupe. Les pics d'ions positifs et négatifs ont ensuite été intégrés et le logiciel SIMCA-P 14.1 (Umetrics, Umea, Suède) a été utilisé pour la reconnaissance des formes. Une correspondance de masse précise (<25 ppm) et une correspondance de spectre secondaire ont été utilisées pour l'identification de la structure des métabolites, et des bases de données telles que la base de données du métabolome humain (HMDB) et la base de données Massbank ont été consultées. Après avoir récupéré les métabolites, les métabolites ont été classés à l'aide du logiciel de recherche MSDIAL. Les données ont été normalisées par échelle de Pareto pour une analyse ultérieure.

L'extraction de l'ADN sanguin a été effectuée conformément au protocole du kit de préparation d'échantillons TruSeq DNA LT (Illumina, San Diego, CA). La qualité de l'ADN a été évaluée en mesurant l'absorbance à une DO de 1,6 à 1,8 à l'aide d'un spectrophotomètre NanoDrop 2000 (Thermo Fischer Scientific, États-Unis), tandis que l'intégrité de l'ADN a été confirmée par électrophorèse sur gel d'agarose à 1 %. Par la suite, la séquence d'ADN a été fragmentée en fragments de 350 à 450 pb à l'aide de Covaris M220. Les extrémités des fragments ont été réparées et phosphorylées, suivies de la connexion de l'adaptateur à l'aide du kit NextFlexTM Rapid DNA-Seq (Bioo Scientific, USA). Enfin, la banque a été amplifiée via 15 cycles de PCR pour enrichir de petits fragments. La qualité et la concentration de la bibliothèque ont été déterminées à l'aide de Qubit (Thermo Fischer Scientific, États-Unis) et le séquençage PE150 a été effectué sur Illumina NovaSeq. plate-forme 6000.

Les données de séquençage ont été enregistrées au format fastq. Le Fastp42 (v0.20.0) a été utilisé avec des paramètres par défaut pour lire, filtrer et profiler la qualité des lectures. BWA37 (v0.7.17) a été utilisé pour cartographier des lectures de haute qualité sur le génome de référence du porc (Sscrofa11.1). Les fichiers SAM ont été convertis en fichiers BAM par SamTools43 (v1.10). Les lectures en double ont été supprimées à l'aide de Sambamba44 (v0.7.1). La couverture et la profondeur des données ont été calculées à l'aide de Mosdepth45 (v0.2.9). GATK46 (v4.1.6) Haplotypecalle a été utilisé pour traiter chaque échantillon et générer un GVCF intermédiaire, qui a été utilisé pour le génotypage conjoint de tous les échantillons dans les GVCF de génotype. Enfin, les SNP ont été filtrés en fonction des critères suivants : (1) QD < 2,0, FS > 60,0, MQ < 40,0, MQRankSum <−12,5, ReadPosRankSum <−8,0, SOR > 3,0 ; (2) fréquence des allèles mineurs (MAF) < 0,01 ; (3) taux d'appel des variantes GATK < 0,9. Le nombre de SNP obtenus est indiqué dans le tableau 4. La distribution de la densité des génotypes a été cartographiée à l'aide du package CMplot R. L'analyse en composantes principales (ACP) a été calculée à l'aide de Plink47 (v1.9). L'analyse de la structure génétique de la population a été réalisée à l'aide d'Admixture48 (v1.3.0). Les analyses PCA et Admixture incluant les SNP des porcs Yorkshire (YS), des porcs Duroc (DU) et des porcs Landrace (LR) ont été obtenues à partir de la base de données PHARP49 (http://alphaindex.zju.edu.cn/PHARP/index.php) . L'analyse FST a été effectuée à l'aide de VCFtools50 (v0.1.13,–fst-window-size 50 000–fst-window-step 10 000. Taille de fenêtre 50 K, taille de pas 10 K). La prédiction de l'expression génique a été réalisée à l'aide du serveur TWAS de FarmGTEx51,52 (http://twas.farmgtex.org/). L'annotation fonctionnelle pour l'ontologie des gènes (GO) et KEGG a été réalisée à l'aide de http://kobas.cbi.pku.edu.cn/.

Le métagénome fécal a généré 34,5 Go et 35 Go de lectures brutes non assemblées à partir d'échantillons LW et LU, respectivement. Après contrôle de la qualité, le rapport de séquence Q20 (bases avec une valeur de masse de 20 en pourcentage du nombre total de bases) a dépassé 96,99 % et le rapport Q30 a dépassé 91,67 %, indiquant que la qualité des données convenait à une analyse plus approfondie. En moyenne, 5,5 millions et 5,7 millions de lectures nettes ont été obtenues à partir des ensembles de données LW et LU, respectivement (tableau 2). La diversité intergroupe des séquences entre les deux races porcines a été calculée à l'aide de l'indice de diversité de Shannon et Simpson, et il n'y avait aucune différence notable dans les séquences globales (Fig. 2C, D). Le groupe LU a été infiltré avec 50 % de gènes LW et maintenu dans un environnement constant pendant environ deux ans, ce qui peut expliquer la composition microbienne indiscriminée des deux groupes de porcs. Les lectures propres ont été assemblées en contigs et regroupées sur la base d'une similarité de 95 % et d'une couverture de 90 % pour générer un catalogue de gènes non redondant comprenant un total de 4,2 millions d'ORF avec une longueur moyenne de 622 paires de bases. L'annotation des gènes a révélé que 262 645 gènes étaient uniques à LU et 350 102 gènes étaient uniques à LW (Fig. 2A). Bien qu'ayant plus de séquences et de contigs que LW, LU avait moins de gènes annotés. Contrairement aux rapports précédents sur le nombre de gènes et la diversité bactérienne inférieurs chez les individus obèses53,54,55, nos résultats montrent que les porcs les plus obèses ont un nombre de gènes plus élevé, ce qui est contraire à la découverte précédente. Les statistiques de fréquence cumulées de l'abondance des gènes des deux races porcines n'ont montré aucune différence significative dans la plupart des intervalles, mais les gènes avec un nombre de près de 40 étaient significativement plus abondants dans LW que dans LU (Fig. 2B). Cette constatation indique que les deux races porcines ont des compositions différentes, principalement situées dans cet intervalle.

Statistiques des gènes microbiens et comparaison de la diversité entre LW et LU. (A) Statistiques génétiques. (B) Statistiques de fréquence cumulative des gènes. (C) Indice de diversité de Shannon. (D). Indice de diversité de Simpson.

L'environnement microbien très similaire de LW et LU peut être attribué au degré élevé d'infiltration de gènes et à l'environnement d'élevage. Cependant, les micro-organismes différentiels restants sont susceptibles d'être impliqués dans le dépôt de graisse, entraînant des différences dans la teneur en graisse des deux races de porcs. Par conséquent, nous avons effectué une analyse plus approfondie pour identifier les différences microbiennes entre LW et LU. Nous avons résumé le microbiome à six niveaux de classification taxonomique, y compris le phylum, la classe, l'ordre, la famille, le genre et l'espèce. Dans LW, nous avons détecté un total de 146 embranchements, 90 classes, 323 ordres, 304 familles, 2 691 genres et 14 570 espèces (tableau 3). Pendant ce temps, LU a montré 145 embranchements, 90 classes, 321 ordres, 306 familles, 2 651 genres et 14 324 espèces (tableau 3). En raison d'annotations taxonomiques inconnues aux niveaux de la classe et de la famille, les statistiques étaient plus faibles. Au niveau de la classification des phylums, les Firmicutes (66,94 %), les Bacteroidetes (17,93 %) et les Proteobacteria (5,69 %) étaient les phylums prédominants, avec les Actinobacteria (2,38 %), les Spirochaetes (1,46 %), les Fibrobacteres (0,62 %) et les Planctomycètes ( 0,5 %) étant également présent en quantités importantes (Fig. 3A, tableau supplémentaire S5). La proportion totale de Firmicutes, Bacteroidetes et Proteobacteria a atteint 91 %, avec la concurrence de niche la plus forte, car le ratio s'échangeait (tableau supplémentaire S1). Au niveau de la classification des genres, les genres prédominants étaient Clostridium (6,55%), Bacteroides (4,93%), Prevotella (7,15%), Streptococcus (4,2%), Oscillibacter (4,05%), Ruminococcus (3,39%), Faecalibacterium (1,8% ) et Eubacterium (1,8%) (Fig. 3B, tableau supplémentaire S2). Nous avons effectué un test de somme des rangs de Wilcoxon pour analyser les différences entre les niveaux taxonomiques du phylum et du genre de LW et LU. Les résultats ont révélé une différence significative dans l'abondance des spirochètes entre LW et LU au niveau de la classification du phylum (Fig. 4A). Il a été rapporté que les spirochètes sont impliqués dans le processus métabolique des glucides56,57,58,59. Au niveau taxonomique du genre, il y avait une différence significative dans l'abondance de Treponema entre LW et LU (Fig. 4B). Treponema est un genre appartenant à Spirochaetes.

Composition du microbiote à forte abondance en LW et LU. (A) Niveau de classification de l'embranchement. (B) Niveau de classification du genre.

Microbiote différentiel aux niveaux taxonomiques du phylum et du genre en LW et LU. (A) Niveau de classification de l'embranchement. (B) Niveau de classification du genre.

Les modèles de flux d'ions totaux (TIC) des échantillons de contrôle de qualité (QC) ont été comparés sous les modes de détection d'ions positifs et négatifs. La force de réponse et le temps de rétention de chaque pic chromatographique se chevauchaient, indiquant que la variation causée par l'erreur de l'instrument est minime et que la qualité des données est fiable. Pour le métabolome fécal, nous avons extrait 12 226 pics d'ions positifs et 6 891 pics d'ions négatifs, dont 703 pics d'ions positifs et 517 pics d'ions négatifs ont été annotés. Les 1 220 métabolites annotés ont été classés en 453 classes, y compris les triterpénoïdes, les acides gras à longue chaîne et les xanthophylles, avec respectivement 53, 19 et 13 types de métabolites (Fig. 5A, Tableau supplémentaire S3). Dans le métabolome sanguin, nous avons détecté 5 977 pics d'ions positifs et 3 081 pics d'ions négatifs, dont 368 pics d'ions positifs et 345 pics d'ions négatifs ont été annotés. Les 713 métabolites annotés ont été classés en 360 classes, y compris les triterpénoïdes, les alcaloïdes diterpénoïdes de type aconitane et les acides alpha-aminés, avec respectivement 15, 14 et 11 métabolites (Fig. 5B, Tableau supplémentaire S4). Il convient de noter que les acides gras à chaîne longue et à chaîne moyenne étaient les principaux acides gras dans les métabolomes fécaux et sanguins. Ces acides gras sont facilement oxydés et hydrolysés et peuvent réduire les lipides sanguins et le cholestérol, ce qui peut être lié à la moindre sensibilité des porcs aux maladies métaboliques liées à l'obésité. La composition du métabolome fécal était similaire à celle du métabolome sanguin, contenant des triterpénoïdes, des xanthophylles, des acides gras à longue chaîne, des acides gras à chaîne moyenne, des lipides et des acides aminés alpha (Fig. 5A, B). La composition des principaux métabolites des deux métabolomes est très similaire et certaines de leurs substances sont probablement apparentées.

Classification des métabolites des métabolomes fécaux et sanguins. (A) Métabolites fécaux du métabolome. (B) Métabolites du métabolome sanguin. Le nombre de composants métabolites est classé par ordre décroissant. Les valeurs numériques indiquent le nombre de métabolites par classe.

Les métabolites sanguins jouent un rôle crucial dans la régulation de la santé physiologique, et la compréhension de leur influence peut donner un aperçu de la façon dont les porcs sont protégés contre les maladies métaboliques. Pour étudier cela, nous avons analysé le métabolome sanguin et mesuré l'intensité de l'influence et la capacité explicative des modèles d'expression des métabolites en utilisant l'importance variable pour la projection (VIP) obtenue via un modèle OPLS-DA. Nous avons sélectionné les métabolites avec VIP> 1 et Pvalue <0, 05 (ANOVA unidirectionnelle pour la comparaison multigroupe) pour identifier ceux présentant des différences significatives. Nos résultats ont révélé 81 métabolites qui différaient significativement entre les deux groupes porcins (tableau supplémentaire S5). Parmi ceux-ci, 41 métabolites étaient plus abondants dans les LW, notamment l'angélicine, la sécurine, l'hypoxanthine, la bétaïne, la cytidine, l'homocystéine, la curdione, l'inosine, l'isopimpinelline, le 5-méthoxypsoralène, la palmitoylcarnitine, le citrate, l'acide stéarique, la cytarabine, la licochalcone A et le N-acétylneuraminique. acide. En revanche, 40 métabolites étaient plus abondants en LU, dont le nitrazépam, l'acétaminophène, l'acide icosanoïque, la gabapentine, la stégatrine, l'acide juarezique, le déhydroeffusol, la gomisine H et l'acide DL-2-hydroxyvalérique. Notamment, certains de ces métabolites sanguins changeants peuvent être liés à la teneur en graisse des porcs, car il a été démontré qu'ils ont des effets anti-adipogenèse et anti-maladies métaboliques chroniques. Par exemple, il a été rapporté que les acides gras hydroxylés présentaient des effets antidiabétiques et anti-inflammatoires60, et la tanshinone IIA est utilisée pour traiter les maladies cardiovasculaires et a des effets anti-adipogenèse61,62,63. La bétaïne a des propriétés anti-foie gras et anti-inflammatoires, qui peuvent prévenir l'hyperglycémie et réduire la résistance à l'insuline64,65,66.

Les échantillons LW et LU ont donné une moyenne de lectures appariées de 22 Go et 21,9 Go, respectivement, à partir desquelles 144,6 millions et 143,5 millions de lectures nettes ont été obtenues après contrôle qualité. La qualité des données génomiques était élevée, avec tous les rapports Q20 de séquence supérieurs à 95,69 % et les rapports Q30 supérieurs à 89,27 % (tableau supplémentaire S6). La profondeur moyenne de séquençage génomique était de 6, 8 fois, avec une couverture atteignant 97%, et un total de 22, 7 millions de SNP (fréquence d'allèle mineur ≥ 0, 05) ont été obtenus à partir de 18 autosomes après assemblage, appel SNP et filtrage des SNP (tableau 4). La haute densité de la diversité des nucléotides dans une fenêtre sans chevauchement de 1 mbyte (Mb) couvre tous les génomes (Fig. 6). Les analyses PCA et des mélanges ont révélé des différences claires dans le pedigree de LW et LU, les races porcines LW et LU étant bien distinguées de la race porcine Yorkshire (Fig. 7A, B). De plus, la méthode Fst a été utilisée pour détecter les signatures de sélection entre LW et LU. La valeur maximale de Fst atteignait 0, 8, ce qui signifie que leur différenciation de groupe est relativement élevée (Fig. 7C). Top 1% Fst peut être annoté à 811 gènes (tableau supplémentaire S7). Ces gènes ont été annotés par enrichissement fonctionnel, résultant en 6 voies GO et 4 voies KEGG, y compris la sécrétion biliaire et la digestion et l'absorption des graisses (tableau supplémentaire S10). L'analyse de l'expression de l'ARN à l'aide du serveur TWAS de FarmGTEx a prédit un total de 2 930 gènes dans les tissus adipeux individuels de LW et LU, dont 146 étaient régulés à la hausse et 266 étaient régulés à la baisse (tableau supplémentaire S8). Les fonctions différentielles des gènes ont été annotées, ce qui a donné 6 voies GO et 9 voies KEGG, y compris le métabolisme de l'amidon et du saccharose et le métabolisme des glycérophospholipides (tableau supplémentaire S10). De plus, l'analyse de corrélation de Spearman a identifié 42 gènes fortement associés au microbiote différentiel Treponema au niveau taxonomique du genre, dont 2 gènes régulés positivement (ENSSSCG00000025565 et ENSSSCG00000049578) et 1 gène régulé négativement RGP1 (| Cor | > 0,6, Pvalue < 0,05, tableau supplémentaire S9) .

Distribution des SNP sur les chromosomes. L'axe des x montre la position chromosomique (en Mb) et l'axe des y représente les chromosomes. Différentes couleurs correspondent au nombre de SNP dans chaque bloc de génome de 1 Mb.

Pedigree et différenciation de groupe entre LW et LU. (A) Résultats de l'analyse en composantes principales des races porcines LW, LU, YS, LR et DU. Les marqueurs bleu, orange, rouge, pruple et vert représentent respectivement les porcs LW, LU, YS, LR et DU. (B) Résultats de la composition des ancêtres avec le nombre supposé d'ascendances à K = 2. K est un paramètre ajustable représentant le nombre de variétés ancestrales possibles. Grâce au calcul de l'erreur de validation croisée, nous avons obtenu K = 2 comme la meilleure valeur de K. (C) Diagramme de Manhattan basé sur Fst de LW et LU.

Cette étude présente quatre ensembles de données distincts : le métagénome fécal, le métabolome fécal, le métabolome sanguin et le génome entier. Les données brutes du métagénome et du génome sont stockées dans l'archive de lecture de séquence NCBI au format fastq. Nous avons effectué un contrôle de qualité préliminaire et des analyses statistiques. Des tableaux supplémentaires contenant le rapport taxonomique sont fournis.

Les fichiers fastq bruts pour les données de séquençage métagénomique sont disponibles dans la base de données NCBI SRA sous BioProject PRJNA74789367 (colonne d'accession NCBI dans le tableau supplémentaire S11), avec le titre du projet "Données métagénomiques des porcs Laiwu et des porcs Lulai". Les fichiers fastq bruts pour les données de séquençage du génome entier (WGS) sont également disponibles dans la base de données NCBI SRA sous BioProject PRJNA74911568 (colonne d'accession NCBI dans le tableau supplémentaire S12), avec le titre du projet "Données de séquençage du génome entier de LW et LL".

Les fichiers bruts des données sur le métabolome fécal et le métabolome sanguin sont stockés dans la base de données MetaboLights69 sous l'identifiant unique de l'étude MTBLS39776970. Le titre du projet est « Données intégrées sur l'axe microbiome-métabolome-génome des porcs Laiwu et Lulai en Chine ».

Nous avons effectué un contrôle de la qualité et une analyse préliminaire des données brutes de plusieurs omiques pour faciliter une réutilisation plus rapide par les chercheurs. Les données statistiques préliminaires sont accessibles par le biais d'informations supplémentaires. Dans le même temps, la pièce jointe de la version Excel a été téléchargée sur http://alphaindex.zju.edu.cn/ALPHADB/download.html. Les informations complémentaires comprennent :

Tableau S1 : Ratio de classification de l'embranchement pour chaque échantillon.

Tableau S2 : Ratio de classification du genre pour chaque échantillon.

Tableau S3 : Liste complète des métabolites fécaux pour les porcs Laiwu et les porcs Lulai.

Tableau S4 : Liste complète des métabolites sanguins pour les porcs Laiwu et les porcs Lulai.

Tableau S5 : 81 métabolites sanguins différents entre les porcs Laiwu et les porcs Lulai.

Tableau S6 : Informations sur les données propres pour l'ensemble du génome.

Tableau S7 : 811 gènes annotés pour les 1 % supérieurs de Fst.

Tableau S8 : 2 930 gènes pour les tissus adipeux prédits à partir des SNP à l'aide du serveur TWAS de FarmGTEx.

Tableau S9 : Forte corrélation entre les gènes prédits et Treponema.

Tableau S10 : Annotation d'enrichissement fonctionnel pour Fst et ARN à l'aide de GO et KEGG.

Tableau S11 : Colonne d'accession NCBI SRA pour PRJNA747893.

Tableau S12 : Colonne d'accession NCBI SRA pour PRJNA749115.

Pour garantir l'authenticité de l'échantillon et prévenir la contamination pendant le processus d'échantillonnage, des gants jetables en PE ont été utilisés pour prélever des échantillons fécaux immédiatement après la défécation par les porcs cibles. Les échantillons ont ensuite été transférés dans des tubes de conservation d'échantillons fécaux spécifiques, et leurs identifiants d'échantillon uniques ont été mis en correspondance avec les identifiants d'extraction et de séquençage de l'ADN. La qualité de l'ADN a été confirmée à l'aide d'un spectrophotomètre NanoDrop 2000 et d'une électrophorèse sur gel d'agarose. Un séquençage d'ADN de haute qualité a été réalisé à l'aide de NovaSeq. Technologie de séquençage 6000. Les données brutes obtenues à partir du séquençage métagénomique et du génome entier ont été soumises à un contrôle de qualité afin d'obtenir des lectures de haute qualité pour une analyse plus approfondie. Les valeurs Q30 pour les données brutes de séquençage métagénomique de 16 échantillons variaient de 91,65 % à 95,8 %. Après contrôle qualité, les valeurs de Q30 variaient de 91,67 % à 95,78 %. Pour les données brutes du génome entier, la plage Q30 était de 88,55 % à 90,45 %, tandis que la plage Q30 des lectures propres après le contrôle de la qualité était de 89 % à 91 %. Pour contrôler l'abondance des gènes métagénomiques, la normalisation des transcriptions par million (TPM) a été utilisée. Le mode de courant ionique total (TIC) des échantillons QC dans les modes de détection d'ions positifs et négatifs a été imposé et comparé. La force de réponse et le temps de rétention de chaque pic chromatographique coïncidaient, ce qui indique que l'erreur de l'instrument était minime et que la qualité des données était fiable.

Les logiciels nécessaires au traitement et à l'analyse des données et à la génération d'images dans cette étude sont accessibles, les versions logicielles sont les suivantes :

1. Trimmomatic (v0.39, http://www.usadellab.org/cms/index.php?page=trimmomatic)

2. BWA (v0.7.17, http://bio-bwa.sourceforge.net)

3. Mégahit (http://i.cs.hku.hk/~alse/hkubrg/projects/idba_ud/)

4. MetaGeneMark (v3.25, http://exon.gatech.edu/meta_gmhmmp.cgi)

5. CD-HIT (http://www.bioinformatics.org/cd-hit/)

6. SOAPaligner (http://soap.genomics.org.cn/)

7. BLASTP (BLAST v2.2.28+, http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)

8. MSDIAL (v4.7, http://prime.psc.riken.jp/compms/msdial/main.html)

9. SIMCA-P (v14.1)

10. Fastp (v0.20.0, http://opengene.org/fastp/fastp)

11. Samtools (v1.10)

12. Parallèle (v0.7.1)

13. Profondeur de profondeur (v0.2.9)

14. Outils picards (v2.0.1)

15. Bcftools (v1.939)

16. GATK (v4.1.6)

17. Plink (v1.9, Index complet des drapeaux - PLINK 1.9 (cog-genomics.org))

18. Mélange (v 1.3.0)

19. Outils VCF (v0.1.13)

20. Serveur TWAS FarmGTEx (http://twas.farmgtex.org/)

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Ce travail a été soutenu financièrement par le programme national clé de recherche et de développement de Chine (2021YFD1200802), le programme provincial clé de R&D du Shandong de Chine (2021LZGC001), la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (numéro de subvention : U21A20249, 32272833) et le programme provincial clé de R&D du Zhejiang. de Chine (2021C02008).

Département des sciences animales, École d'agriculture et de biologie, Université Jiao Tong de Shanghai, Shanghai, 200240, République populaire de Chine

Xueshuang Lai, Qamar Raza Qadri et Yifei Fang

Département des sciences animales, Collège des sciences animales, Université du Zhejiang, Hangzhou, 310030, République populaire de Chine

Xueshuang Lai, Zhenyang Zhang, Zhe Zhang, Shengqiang Liu, Zitao Chen, Yifei Fang, Zhen Wang, Yuchun Pan et Qishan Wang

Institut Hainan, Université du Zhejiang, Sanya, 310014, République populaire de Chine

Shengqiang Liu, Yuchun Pan et Qishan Wang

Département des sciences animales, Collège des sciences animales, Université de Jilin, Changchui, 130015, République populaire de Chine

Chunyan Bai

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Yuchun Pan et Qishan Wang ont conçu et conçu cette étude. Xueshuang Lai a écrit le manuscrit. Zitao Chen et Chunyan Bai ont collecté les échantillons. Xueshuang Lai et Zhenyang Zhang ont construit les bibliothèques d'ADN. Xueshuang Lai, Zhenyang Zhang, Zhe Zhang, Shengqiang Liu et Zhen Wang effectué l'analyse des données. Qishan Wang, Zhe Zhang, Qamar Raza Qadri et Yifei Fang ont édité le manuscrit. Tous les auteurs ont lu et approuvé le manuscrit final.

Correspondance à Yuchun Pan ou Qishan Wang.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Lai, X., Zhang, Z., Zhang, Z. et al. Données intégrées sur l'axe microbiome-métabolome-génome des porcs Laiwu et Lulai. Sci Data 10, 280 (2023). https://doi.org/10.1038/s41597-023-02191-2

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Reçu : 13 septembre 2022

Accepté : 27 avril 2023

Publié: 13 mai 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41597-023-02191-2

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